Rekombinantās DNS gēnu inženierija

Klona izolēšana

Parasti klonēšanu veic, lai iegūtu viena konkrēta interesējošā gēna vai DNS secības klonu. Tāpēc nākamais solis pēc klonēšanas ir atrast un izolēt šo klonu starp citiem bibliotēkas locekļiem. Ja bibliotēka aptver visu organisma genomu, tad kaut kur šajā bibliotēkā atradīsies vēlamais klons. Atkarībā no konkrētā gēna to var atrast vairākos veidos. Visbiežāk kā zondi izmanto klonētu DNS segmentu, kas parāda homoloģiju ar meklēto gēnu. Piemēram, ja peles gēns jau ir klonēts, tad šo klonu var izmantot, lai atrastu līdzvērtīgu cilvēka klonu no cilvēka genoma bibliotēkas. Baktēriju kolonijas, kas veido bibliotēku, audzē Petri trauku kolekcijā. Pēc tam virs katras plāksnes virsmas tiek uzlikta poraina membrāna, un šūnas pielīmē pie membrānas. Šūnas tiek saplēstas, un DNS tiek sadalīta atsevišķās daļās - visas uz membrānas. Zondi arī sadala atsevišķās daļās un marķē, bieži ar radioaktīvo fosforu. Pēc tam membrānas peldēšanai izmanto radioaktīvās zondes šķīdumu. Vienpavediena zondes DNS pielipīs tikai klona DNS, kas satur ekvivalentu gēnu. Membrāna tiek žāvēta un novietota pret radiācijas jutīgas plēves loksni, un kaut kur uz filmām parādīsies melns plankums, kas paziņo par vēlamā klona klātbūtni un atrašanās vietu. Pēc tam klonu var iegūt no oriģinālajiem Petri ēdieniem.

ģenētika: rekombinantās DNS tehnoloģija un polimerāzes ķēdes reakcija

Ģenētiskās izpratnes attīstībā svarīga loma ir bijusi tehnikas attīstībai. 1970. gadā amerikāņu mikrobiologi Daniels Natans

.

DNS sekvencēšana

Kad DNS segments ir klonēts, var noteikt tā nukleotīdu secību. Nukleotīdu secība ir visbūtiskākais zināšanu līmenis par gēnu vai genomu. Tieši projektā ir norādījumi par organisma veidošanu, un, nesaņemot šo informāciju, ģenētiskā funkcija vai evolūcija nevarētu būt pilnīga.

Lietojumi

Zināšanas par DNS segmenta secību ir daudz izmantojamas, un seko daži piemēri. Pirmkārt, to var izmantot, lai atrastu gēnus, DNS segmentus, kas kodē noteiktu olbaltumvielu vai fenotipu. Ja DNS reģions ir sakārtots, to var pārbaudīt gēnu raksturīgajām iezīmēm. Piemēram, atvērtie lasāmie rāmji (ORF) - garas sekvences, kas sākas ar sākuma kodonu (trīs blakus esoši nukleotīdi; kodona secība nosaka aminoskābju ražošanu) un ko nepārtrauc apturošie kodoni (izņemot vienu to galā) - iesaka olbaltumvielu kodēšanas reģions. Arī cilvēka gēni parasti atrodas blakus tā saucamajām CpG salām - citozīna un guanīna kopām, diviem no nukleotīdiem, kas veido DNS. Ja ir zināms, ka gēns ar zināmu fenotipu (piemēram, kā slimības gēns cilvēkiem) atrodas secīgā hromosomā reģionā, tad nepiešķirtie gēni šajā reģionā kļūs par šīs funkcijas kandidātiem. Otrkārt, var salīdzināt dažādu organismu homologās DNS sekvences, lai attēlotu evolūcijas attiecības gan sugu iekšienē, gan starp tām. Treškārt, gēnu sekvenci var pārbaudīt funkcionālajos reģionos. Lai noteiktu gēna funkciju, var identificēt dažādus domēnus, kas ir kopīgi līdzīgas funkcijas olbaltumvielām. Piemēram, noteiktas aminoskābju sekvences gēnā vienmēr ir atrodamas olbaltumvielās, kas aptver šūnu membrānu; šādus aminoskābju posmus sauc par transmembranāliem domēniem. Ja transmembrāns domēns tiek atrasts nezināmas funkcijas gēnā, tas liek domāt, ka kodētais proteīns atrodas šūnu membrānā. Citi domēni raksturo DNS saistošos proteīnus. Jebkurai ieinteresētai personai ir pieejamas vairākas publiskas DNS sekvenču datu bāzes.